外顯子
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外顯子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍會被保存下來，并可在蛋白質(zhì)生物合成過程中被表達(dá)為蛋白質(zhì)。外顯子是最后出現(xiàn)在成熟RNA中的基因序列,又稱表達(dá)序列。既存在于最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。術(shù)語外顯子也指編碼相應(yīng)RNA外顯子的DNA中的區(qū)域。所有的外顯子一同組成了遺傳信息，該信息會體現(xiàn)在蛋白質(zhì)上。
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基因反應(yīng)
剪接方式并不是唯一的(參看替代剪接)，所以外顯子只能在成體mRNA中被看出。即使是使用生物信息學(xué)方法，要精確預(yù)測外顯子的位置也是非常困難的。 真核生物的基因，其線性表達(dá)被內(nèi)含子阻斷，這就是所謂的斷裂基因(英語splitgene)，該現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)者RichardJ.Roberts和PhillipA.Sharp獲得了1993年諾貝爾獎。
在反式剪接中，不同mRNA的外顯子可以被接合在一起。外顯子在剪接(Splicing)后仍會被保存下來，并可在蛋白質(zhì)生物合成過程中被表達(dá)為蛋白質(zhì)。外顯子是最后出現(xiàn)在成熟RNA中的基因序列，又稱表達(dá)序列。既存在于最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。術(shù)語外顯子也指編碼相應(yīng)RNA外顯子的DNA中的區(qū)域。簡言之，外顯子就是指真核細(xì)胞的基因在表達(dá)過程中能編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列。關(guān)鍵概念：比較不同物種的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的外顯子序列通常是保守的，而內(nèi)含子序列則很少保守。編碼蛋白質(zhì)的序列通常處于選擇壓力之下，內(nèi)含子由于沒有選擇壓力，因此比外顯子的進(jìn)化快得多。通過確定在多種生物中出現(xiàn)的片段來鑒定編碼區(qū)域，而外顯子的保守性可以作為這種鑒定的基礎(chǔ)。
人類大部分基因組序列都是被垃圾DNA序列分隔成一段段，給定一個已知的目標(biāo)蛋白質(zhì)和基因組序列，在該基因組序列中找出一組子字符串（候選外顯子），使得其拼接（剪接）與目標(biāo)蛋白質(zhì)最匹配（即去掉垃圾DNA序列）。一個強(qiáng)力方法是尋找基因組序列與目標(biāo)蛋白質(zhì)序列間的所有局部相似性。若第一個取自基因組序列的子字符串展示了充分相似性于目標(biāo)蛋白質(zhì)，那么這個子字符串可被認(rèn)為是一個推定的外顯子。將推定外顯子結(jié)構(gòu)化為基因組序列中的賦權(quán)區(qū)間，它可用三個參數(shù)（l、r、w）來描述，l、r分別是推定的外顯子的左邊、右邊的位置，w為其權(quán)重。權(quán)重w可反該區(qū)間是一個外顯子的可能性。鏈?zhǔn)遣恢丿B賦權(quán)區(qū)間的任一集合，一個鏈的總權(quán)重是該鏈中所有區(qū)間的權(quán)重之和。給定一個推定的外顯子集，尋找非重疊的推定的外顯子的一個最大集。輸入：賦權(quán)區(qū)間（推定的外顯子）集。輸出：該集合中區(qū)間的最大?！ ?/p>
基因捕捉
外顯子捕捉(exontrapping)是構(gòu)建一種載體，從其插入片段中識別和回收外顯子序列，從而克隆目的基因。捕捉外顯子的載體pETV—SD是一種反轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體(shuttlevector)，即可在不同種生物中如大腸桿菌和酵母，細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞等進(jìn)行復(fù)制的載體(見圖5-14)。因為凡是有內(nèi)含子和外顯子的基因在轉(zhuǎn)錄后都要經(jīng)過RNA剪接，這就需要有剪接供體(splicingdonor，SD)位點和剪接受體(splicingacceptor，SA)位點。因此，SA位點可作為基因的標(biāo)志。pETV—咀載體的克隆位點上游有一個“外顯子捕捉序列”
(exontrapcassette)，可用來識別載體的插入片段中有無SA位點。它含有β-珠蛋白(HBG)基因的第1個外顯子及其有功能的SD位點，該基因的間隔序列(IVS)和α，β-半乳糖苷酶(αβ-GAL)基因。操作步驟及其基本原理是：
(1)基因組DNA經(jīng)“霰彈法”切成小片段后，克隆在位于“外顯子捕捉序列”下游的克隆位點上。
(2)將這些重組載體匯總后感染反轉(zhuǎn)錄病毒的專宿包裝細(xì)胞系(ecotropicretroviralpackagingcellline)——ψ2細(xì)胞系。ψ2細(xì)胞提供蛋白質(zhì)產(chǎn)物使載體(自身不能合成病毒蛋白質(zhì))成為反轉(zhuǎn)錄病毒在細(xì)胞里增殖。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄病毒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄時，如果插入片段中包含有功能的SA位點，則有可能發(fā)生RNA剪接反應(yīng)而將IVS切除。
(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包裝在病毒子(virion)中，從細(xì)胞培養(yǎng)液中收集后用來感染兼宿反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系(amphotropicretroviralpackagingcellline)PA-317。這使反轉(zhuǎn)錄病毒再進(jìn)行一輪復(fù)制，并產(chǎn)生能感染猴腎細(xì)胞系COS細(xì)胞的高效價病毒原種。這樣做是由于上一輪克隆在病毒中的插入片段的剪接效率極低，而在第二輪復(fù)制時則大大提高了RNA剪接的機(jī)會。
(4)從第二個細(xì)胞系PA-317細(xì)胞中分離得到的病毒，用來感染組成型產(chǎn)生SV40T(腫瘤)抗原的COS細(xì)胞。病毒RNA基因組被反轉(zhuǎn)錄，并在載體上的SV40復(fù)制起點作用下，以環(huán)狀DNA附加體形式進(jìn)行復(fù)制。
(5)從COS細(xì)胞中回收復(fù)制的附加體DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶DpnI酶切后轉(zhuǎn)化細(xì)菌。在含卡那霉素(Kn)和5-氯—4-溴—3-吲哚—β-D-半乳糖苷(X-gal)的培養(yǎng)基上挑選轉(zhuǎn)化子。盧—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成藍(lán)色產(chǎn)物。因此，不產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化子菌落則呈白色。
(6)只挑選出白色菌落作進(jìn)一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二種原因。一是由于基因發(fā)生突變，使夕—半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期的RNA時期中發(fā)生了剪接反應(yīng)，從而丟失了α,β-半乳糖苷酶基因。
(7)如果是基因突變，則大多數(shù)將是缺失了載體中的“外顯子捕捉”部分，就可用人的口—珠蛋白基因片段為探針作菌落雜交，很快可得到驗證。
(8)如果是真正發(fā)生了RNA剪接事件，準(zhǔn)確的剪接反應(yīng)可切除作為標(biāo)記的IVS，使人口—珠蛋白基因的第1外顯子與落入了捕捉陷阱的插入片段中的外顯子序列連接，這可直接測定其序列加以證明。從捕捉到的外顯子出發(fā)，就可進(jìn)一步用作探針去從基因組基因文庫或cDNA文庫中分離出基因?！ ?/p>
應(yīng)用機(jī)理
應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphsim,PCR-SSCP)及DNA直接測序技術(shù)檢測68例SAD患者和65名正常老年人的早老素-1基因第5外顯子。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)68例SAD患者中有4例患者的SSCP發(fā)生泳動異常，DNA序列分析發(fā)現(xiàn)：這4例SAD患者的130
號密碼子發(fā)了CTG→ATG錯義突變(388位點發(fā)生C→A突變)，使氨基酸由亮氨酸變?yōu)?a href="/w/%E8%9B%8B%E6%B0%A8%E9%85%B8" title="蛋氨酸" class="mw-redirect">蛋氨酸(Leu130Met)；157號密碼子發(fā)生了GTG→CTG錯義突變(469位點發(fā)生G→C突變)，使氨基酸由纈氨酸變?yōu)榱涟彼?Val157Leu)；有11例患者的SSCP表現(xiàn)為一條單鏈電泳遷移率明顯增快，DNA序列分析發(fā)現(xiàn)：這11例SAD患者的130號密碼子發(fā)生了CTG→ATG錯義突變(388位點發(fā)生C→A突變)，使氨基酸由亮氨酸變?yōu)榈鞍彼?Leu130Met)；154號密碼子發(fā)生了TGC→TGT同義突變(462位點發(fā)生C→T)突變。結(jié)論，發(fā)現(xiàn)在SAD患者中存在早老素-1基因第5外顯子突變，該突變點可能為中國人SAD患者早老素基因突變點。
多數(shù)早發(fā)性家族性阿爾茨海默氏病(familialalzheimer'sdisease,FAD)與14號染色體上的早老素-1(presenilin-1,PS-1)基因突變有關(guān)，少數(shù)早發(fā)性FAD與PS-2基因突變有關(guān)。早老素基因與散發(fā)性Alzheimer病(sporadicalzheimer'sdisease,SAD)的關(guān)系，目前國內(nèi)外研究較少，為探討PS-1基因突變在SAD發(fā)病機(jī)理中的作用，我們用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP)、DNA直接測序技術(shù)檢測了68例SAD患者及65名正常老年人PS-1基因第5外顯子，發(fā)現(xiàn)在SAD患者中也存在PS-1基因第5外顯子突?！ ?/p>
跳躍突變
超過一半的基因編碼區(qū)的單核苷酸突變引起的疾病都是影響了RNA的剪切。例如這些突變導(dǎo)致基因的外顯子缺失，被稱為外顯子跳躍現(xiàn)象。如果能將外顯子重新恢復(fù)到基因轉(zhuǎn)錄本中去將會給許多疾病的治療帶來曙光。AdrianKrainerandLucaCartegni開發(fā)了一種新的方法ESSENCE（exon-specificsilencingenhancementbysmallchimericeffectors），模仿基本剪切因子SR（serine/arginine）蛋白
的功能糾正這些遺傳的突變。SR蛋白結(jié)合于外顯子剪切增強(qiáng)因子（ESE-exonicsplicingenhancers），將剪切所需要的功能蛋白通過自身的結(jié)構(gòu)域（幾個精氨酸和絲氨酸組成的二肽）招募到轉(zhuǎn)錄本上來。
AdrianKrainerandLucaCartegni為了在外顯子跳躍突變中恢復(fù)正常的外顯子，將一個合成的RS（精氨酸-絲氨酸）結(jié)構(gòu)域融合到能夠與特異性外顯子結(jié)合的反義核苷酸片段上。他們首先檢測了ESSENCE方法對乳腺癌基因1（BRCA1）突變的作用，BRCA1在外顯子18上的ESE突變會導(dǎo)致外顯子跳躍。他們發(fā)現(xiàn)將ESSENCE化合物與能夠與外顯子18反義結(jié)合的片段融合作用后在體外能夠恢復(fù)正常的剪切，其中反義片段和RS片段都是必需的。
研究者接著對另一種外顯子跳躍突變導(dǎo)致的疾病模型進(jìn)行研究。神經(jīng)退行性疾病脊髓肌肉萎縮由運(yùn)動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）的功能性拷貝缺失導(dǎo)致。SMN1的缺失可以有SMN2的功能所補(bǔ)償，但SMN2的外顯子7的單核苷酸突變會導(dǎo)致整個外顯子缺失。研究者發(fā)現(xiàn)用ESSENCE方法也能在體外恢復(fù)SMN2突變?nèi)笔У耐怙@子7。這個新方法雖然還需要體內(nèi)的許多研究數(shù)據(jù)，但顯然對相關(guān)遺傳疾病的治療確實帶來的曙光?！ ?/p>
基因識別
許多基因中遺傳上的“無義”片段－－即內(nèi)含子，會妨礙基因指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成?，F(xiàn)在，一篇發(fā)表于3月11日期的《自然遺傳學(xué)》雜志上的文章提出了基因識別這些內(nèi)含子的新機(jī)制。
細(xì)胞產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)時，首先需要將編碼蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化成RNA分子，接下來，通過細(xì)胞的剪接機(jī)制除去有潛在破壞作用的內(nèi)含子，再把基因序列中剩下的所謂外顯子接合到一起。許多遺傳缺陷都是由于剪接過程出錯引起的。當(dāng)內(nèi)含子邊緣堿基發(fā)生突變，剪接酶無法識別時，剪接過程通常就要出錯。但現(xiàn)在，由FranciscoBaralle領(lǐng)導(dǎo)的意大利國際遺傳工程和生物技術(shù)中心的研究人員發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子中間堿基的突變也能夠改變剪接機(jī)制處理內(nèi)含子的方式。
研究小組分析了神經(jīng)退行性變疾病－－共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張（ataxia-telangiectasia，A-T)病人的DNA序列。他們發(fā)現(xiàn)，致病基因中內(nèi)含子20內(nèi)部的4個堿基對丟失了。但病人免疫系統(tǒng)細(xì)胞中的信使RNA鏈卻比正常細(xì)胞中的長，研究人員證明這是由于RNA鏈中含有多余的內(nèi)含子引起的。換句話說，內(nèi)含子中4個堿基對的缺失產(chǎn)生令人驚異的效果－－缺失的堿基對轉(zhuǎn)移到外顯子中去了：即當(dāng)“剪接機(jī)器”啟動開始工作時，內(nèi)含子已經(jīng)離開“剪接室”，溜之大吉了。
為進(jìn)一步驗證實驗結(jié)果，Baralle的研究小組將含有A-T病人中缺失的這個堿基對，共由12堿基對組成的健康基因序列插入到一個完全不同基因的外顯子中。令人驚異的是，剪接機(jī)制開始把整個外顯子當(dāng)作內(nèi)含子處理，將該外顯子剪切掉。Baralle得出結(jié)論：實驗結(jié)果表明，這個序列行使作用時，能夠幫助剪接酶識別內(nèi)含子；缺失時（如在A-T病人中)，就會錯移到外顯子中去。Baralle猜測，這個序列可能也控制著其它基因的剪接，對引起包括癌癥在內(nèi)的各種疾病有一定作用。
這項工作標(biāo)志著一次“重大發(fā)現(xiàn)”，紐約城哥倫比亞大學(xué)的JimManley評價道。Manley認(rèn)為內(nèi)含子中間的這段關(guān)鍵序列也許是幫助剪接機(jī)制識別和除去內(nèi)含子的“踏腳石”。在整個基因組中，可能存在“幾十個類似機(jī)制”來確定內(nèi)含子的組成
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