流式細(xì)胞術(shù)
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流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一種對液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒（如微球，細(xì)菌，小型模式生物等）逐個進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)。作為應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測的技術(shù)平臺，現(xiàn)代流式細(xì)胞儀產(chǎn)生于上世紀(jì)六七十年代。經(jīng)過近四十年的發(fā)展和完善，今天的流式細(xì)胞儀已經(jīng)十分成熟，并被廣泛的運用于從基礎(chǔ)研究到臨床實踐的各個方面，涵蓋了細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗等領(lǐng)域，在各學(xué)科中發(fā)揮著重要的作用。
目錄 |
概述
一種在液流系統(tǒng)中，快速測定單個細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)，并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類收集的技術(shù)。其特點是通過快速測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來定量測定細(xì)胞 DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)。根據(jù)這些參數(shù)將不同性質(zhì)的細(xì)胞分開，以獲得供生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究用的純細(xì)胞群體。目前最高分選速度已達(dá)到每秒鐘3萬個細(xì)胞。
現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)綜合了流體力學(xué)技術(shù)、激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)、熒光化學(xué)技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)，是多學(xué)科多領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)步的結(jié)晶。隨著現(xiàn)代科技的高速發(fā)展，為了滿足生命科學(xué)對細(xì)胞分析更高層次的要求，流式細(xì)胞技術(shù)仍然在快速發(fā)展，并已經(jīng)在檢測技術(shù)、分選技術(shù)及高通量分析等方面取得了許多突破。
簡史
1934年A.莫爾達(dá)萬首次報道了使懸浮的紅細(xì)胞通過放置在顯微鏡載物臺上的玻璃毛細(xì)管的細(xì)胞自動計數(shù)方法。1956年W.H.庫爾特介紹一種利用細(xì)胞在導(dǎo)電溶液中,通過兩個小室間小孔（75～100微米）時的電阻變化（稱為庫爾特電阻）進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和測定細(xì)胞體積的裝置。1965年L.A.卡門茨基制成了多參數(shù)流式細(xì)胞計，可測定細(xì)胞大小和核酸含量。同年，M.J.富爾懷勒又制成細(xì)胞分選器。1969年范迪拉等應(yīng)用氬離子激光器和分層殼流技術(shù)，建立了一臺液流、照明光軸和檢測器軸互相正交的流式細(xì)胞計。
以后，經(jīng)H.R.休利特等改進(jìn)了的細(xì)胞分選計，能使流動液體內(nèi)的細(xì)胞噴射到空氣中進(jìn)行測量。但上述各系統(tǒng)中，所使用的激光光束以及設(shè)在收集熒光的檢測方向上的限制光欄都比液流中的細(xì)胞大，因而不能提供關(guān)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的信息，故稱為零分辨率系統(tǒng)。隨后，L.L.惠利斯和S.F.帕滕發(fā)展了一種低分辨率的狹縫掃描技術(shù)，可以測定細(xì)胞核熒光、細(xì)胞和細(xì)胞核的大小。1969年，W.格德和W.迪特里希描述了使用汞燈做光源的流式細(xì)胞光度計，在落射光照明下，可激發(fā)在流動室中與光軸平行流動的細(xì)胞。
原理
待測樣品(如細(xì)胞、染色體、精子或細(xì)菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍的進(jìn)樣管而進(jìn)入流動室，排成單列的細(xì)胞，由流動室的噴嘴噴出而成為細(xì)胞液流，并與入射激光束相交。細(xì)胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細(xì)胞液流成 90°處的光學(xué)系統(tǒng)收集之。光學(xué)系統(tǒng)中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長。熒光檢測器為光電倍增管。散射光檢測器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細(xì)胞大小有關(guān)。
整個儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號和光散射信號。測定的結(jié)果用單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來表示。
對細(xì)胞進(jìn)行分選的原理是，由超聲振蕩器產(chǎn)生高頻振蕩，使流動室發(fā)生振動，把噴嘴噴出的細(xì)胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，有的液滴含有細(xì)胞。這些細(xì)胞在形成液滴前，光學(xué)系統(tǒng)已測定了它們的信號（代表細(xì)胞的性質(zhì)），如果測得信號與所選定的要進(jìn)行分選的細(xì)胞性質(zhì)符合，或者說，如果發(fā)現(xiàn)了要進(jìn)行分選的細(xì)胞時則在這個選定細(xì)胞剛形成液滴時，儀器給整個液流充以短暫的正或負(fù)電荷。當(dāng)該液滴離開液流后，其中被選定細(xì)胞的液滴就帶有電荷，而不被選定的細(xì)胞液滴則不帶電。帶有正電或負(fù)電的液滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板時發(fā)生向陰極或向陽極的偏轉(zhuǎn)，從而達(dá)到了分類收集細(xì)胞的目的。
應(yīng)用
細(xì)胞生物學(xué)研究
流式細(xì)胞術(shù)可用于測定細(xì)胞周期各時相細(xì)胞的百分比。通過測定細(xì)胞群體中每個細(xì)胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲線。例如，在測定Hela細(xì)胞DNA含量分布曲線上，第一個峰是含有2CDNA含量的G1/G0（DNA合成前期/靜止期）細(xì)胞,其次一個峰是4CDNA含量的G2+M(DNA合成后期＋有絲分裂期)細(xì)胞，從2C～4C間的區(qū)域為S期（DNA合成期）細(xì)胞。采用繪圖法或計算機(jī)擬合法可計算出細(xì)胞周期各時相細(xì)胞占整個細(xì)胞群體的百分?jǐn)?shù)。
用流式細(xì)胞術(shù)可進(jìn)行多參數(shù)分析，即同時測定一個細(xì)胞的多種性質(zhì)。如散射光和熒光，或多種不同顏色的熒光。例如細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后，DNA發(fā)綠色熒光，RNA發(fā)紅色熒光。測定這兩種熒光就能同時得知一個細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA含量。測定結(jié)果可用二維散點圖或三維立體圖表示。用這種方法可根據(jù)DNA和RNA含量而鑒別出G0與G1、M期和 G2期細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)與液體閃爍技術(shù)相配合,還可求得細(xì)胞通過G1、S和G2+M期的時間(T、Ts、T+M及其變異系數(shù)。近年利用抗溴脫氧尿苷(Brdurd)單克隆抗體能發(fā)現(xiàn)滲入到細(xì)胞 DNA內(nèi)的溴脫氧尿苷。將此種熒光抗體技術(shù)與測定細(xì)胞 DNA含量相結(jié)合，是研究DNA合成和細(xì)胞周期的一種非常有用的技術(shù)。此外,流式細(xì)胞術(shù)還可測定細(xì)胞群體同步化的程度和所處的時期，鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞，利用熒光標(biāo)記配體，還可定量測定細(xì)胞表面和內(nèi)部的受體等。
遺傳學(xué)研究
用流式細(xì)胞術(shù)測定染色體DNA含量,可得到染色體頻率分布圖，稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現(xiàn)一個峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式染色體核型分析技術(shù)不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體,做成人類每條染色體的DNA文庫，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。
免疫學(xué)研究
結(jié)合免疫熒光方法，流式細(xì)胞術(shù)可辨認(rèn)和計數(shù)帶有不同表面特異性抗原的細(xì)胞，例如用熒光素標(biāo)記的免疫球蛋白鑒別T和B淋巴細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞表面抗原的不同,進(jìn)一步分辨出不同的T和B淋巴細(xì)胞亞群，以及測定每個細(xì)胞所帶抗原的數(shù)量、密度及其動力學(xué)參數(shù)等。也可用流式細(xì)胞分選技術(shù)將帶有“＋”和不帶有“－”的某種特異抗原的細(xì)胞群體分類收集，供研究其功能特性。
流式細(xì)胞術(shù)對于判斷免疫缺陷癥，如愛滋病（獲得性免疫缺損綜合征）的重要特征，即T4和T8淋巴細(xì)胞比例改變（T4細(xì)胞大量減少）以及判斷自身免疫病和確定白血病、淋巴癌的表型等，都是非常有用的。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可用于定量分析結(jié)合于細(xì)胞上的熒光素標(biāo)記的外源凝集素，測定細(xì)胞表面積和熒光素結(jié)合位點的相對密度，結(jié)合細(xì)胞動力學(xué)測定每個細(xì)胞結(jié)合位點的數(shù)目，以及研究各種外源凝集素與細(xì)胞表面結(jié)合的競爭性等。
腫瘤學(xué)研究
腫瘤細(xì)胞一般都含有異常數(shù)量的 DNA。在大多數(shù)實體瘤和急性白血病中都發(fā)現(xiàn)有非整倍體的細(xì)胞，由于流式細(xì)胞術(shù)樣品制備方法簡單，測定結(jié)果精確，能快速得到有關(guān)DNA倍性的信息,因而能提供有價值的診斷數(shù)據(jù)。如果在測量 DNA含量的同時，再測定其他參數(shù)（如不同類型的中等纖維蛋白，蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞大小、核質(zhì)比等）則可進(jìn)一步提高診斷的可靠性。
流式細(xì)胞術(shù)可在實驗和臨床中評價腫瘤化療和放療的作用，現(xiàn)在根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞動力學(xué)數(shù)據(jù)來監(jiān)視腫瘤治療的工作已經(jīng)在實際工作中開展起來。
此外，流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域中也得到廣泛的應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)正在向高靈敏、高速度、多參數(shù)測量、獲取形態(tài)學(xué)信息等方面發(fā)展。
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