色譜法
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色譜法（chromatography）又稱“色譜分析”、“色譜分析法”、“層析法”，是一種分離和分析方法，在分析化學(xué)、有機化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。
目錄 |
簡介
色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。色譜法起源于20世紀初，1950年代之后飛速發(fā)展，并發(fā)展出一個獨立的三級學(xué)科-色譜學(xué)。歷史上曾經(jīng)先后有兩位化學(xué)家因為在色譜領(lǐng)域的突出貢獻而獲得諾貝爾化學(xué)獎，此外色譜分析方法還在12項獲得諾貝爾化學(xué)獎的研究工作中起到關(guān)鍵作用。
歷史
色譜法從二十世紀初發(fā)明以來，經(jīng)歷了整整一個世紀的發(fā)展到今天已經(jīng)成為最重要的分離分析科學(xué)，廣泛地應(yīng)用于許多領(lǐng)域，如石油化工、有機合成、生理生化、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護，乃至空間探索等。 將一滴含有混合色素的溶液滴在一塊布或一片紙上，隨著溶液的展開可以觀察到一個個同心圓環(huán)出現(xiàn)，這種層析現(xiàn)象雖然古人就已有初步認識并有一些簡單的應(yīng)用，但真正首先認識到這種層析現(xiàn)象在分離分析方面具有重大價值的是俄國植物學(xué)家Tswett。 Tswett關(guān)于色譜分離方法的研究始于1901年，兩年后他發(fā)表了他的研究成果"一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應(yīng)用，提出了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法。三年后，他將這種方法命名為色譜法（Chromatography），很顯然色譜法 （Chromatography）這個詞是由顏色（chrom）和圖譜(graph)這兩個詞根組成的，派生詞有chromatograph（色譜儀），chromatogram（色譜圖），chromatographer（色譜工作者）等。由于Tswett的開創(chuàng)性工作，因此人們尊稱他為"色譜學(xué)之父"，而以他的名字命名的Tswett獎也成為了色譜界的最高榮譽獎。 色譜法發(fā)明后的最初二三十年發(fā)展非常緩慢。液-固色譜的進一步發(fā)展有賴于瑞典科學(xué)家Tiselius（1948年Nobel Chemistry Prize獲得者）和Claesson的努力，他們創(chuàng)立了液相色譜的迎頭法和頂替法。分配色譜是由著名的英國科學(xué)家Martin和
Synge創(chuàng)立的，他們因此而獲得1952年的諾貝爾化學(xué)獎。1941年，Martin和Synge采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動相分離氨基酸，他們在這一工作的論文中預(yù)言了用氣體代替液體作為流動相來分離各類化合物的可能性。 1951年，Martin和James報道了用自動滴定儀作檢測器分析脂肪酸，創(chuàng)立了氣-液色譜法；1958年，Golay首先提出了分離效能極高的毛細管柱氣相色譜法，發(fā)明了玻璃毛細管拉制機，從此氣相色譜法超過最先發(fā)明的液相色譜法而迅速發(fā)展起來，今天常用的氣相色譜檢測器也幾乎是在五十年代發(fā)展起來的。七十年代發(fā)明了石英毛細管柱和固定液的交聯(lián)技術(shù)。隨著電子技術(shù)和計算機技術(shù)的發(fā)展氣相色譜儀器也在不斷發(fā)展完善中，到現(xiàn)在最先進的氣相色譜儀已實現(xiàn)了全自動化和計算機控制，并可通過網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)遠程診斷和控制?！ ?/p>
色譜的起源
色譜法起源于20世紀初，1906年俄國植物學(xué)家米哈伊爾.茨維特用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過一段時間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實現(xiàn)分離，由一條色帶分散為數(shù)條平行的色帶。由于這一實驗將混合的植物色素分離為不同的色帶，因此茨維特將這種方法命名為Хроматография，這個單詞最終被英語等拼音語言接受，成為色譜法的名稱。漢語中的色譜也是對這個單詞的意譯。
茨維特并非著名科學(xué)家，他對色譜的研究以俄語發(fā)表在俄國的學(xué)術(shù)雜志之后不久，第一次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，歐洲正常的學(xué)術(shù)交流被迫終止。這些因素使得色譜法問世后十余年間不為學(xué)術(shù)界所知，直到1931年德國柏林威廉皇帝研究所的庫恩將茨維特的方法應(yīng)用于葉紅素和葉黃素的研究，庫恩的研究獲得了廣泛的承認，也讓科學(xué)界接受了色譜法，此后的一段時間內(nèi)，以氧化鋁為固定相的色譜法在有色物質(zhì)的分離中取得了廣泛的應(yīng)用，這就是今天的吸附色譜。
分配色譜的出現(xiàn)和色譜方法的普及
1938年阿切爾.約翰.波特.馬丁和理查德.勞倫斯.米林頓.辛格準備利用氨基酸在水和有機溶劑中的溶解度差異分離不同種類的氨基酸，馬丁早期曾經(jīng)設(shè)計了逆流萃取系統(tǒng)以分離維生素，馬丁和辛格準備用兩種逆向流動的溶劑分離氨基酸，但是沒有獲得成功。后來他們將水吸附在固相的硅膠上，以氯仿沖洗，成功地分離了氨基酸，這就是現(xiàn)在常用的分配色譜。在獲得成功之后，馬丁和辛格的方法被廣泛應(yīng)用于各種有機物的分離。1943年馬丁以及辛格又發(fā)明了在蒸汽飽和環(huán)境下進行的紙色譜法?！ ?/p>
氣相色譜和色譜理論的出現(xiàn)
1952年馬丁和詹姆斯提出用氣體作為流動相進行色譜分離的想法，他們用硅藻土吸附的硅酮油作為固定相，用氮氣作為流動相分離了若干種小分子量揮發(fā)性有機酸。
氣相色譜的出現(xiàn)使色譜技術(shù)從最初的定性分離手段進一步演化為具有分離功能的定量測定手段，并且極大的刺激了色譜技術(shù)和理論的發(fā)展。相比于早期的液相色譜，以氣體為流動相的色譜對設(shè)備的要求更高，這促進了色譜技術(shù)的機械化、標準化和自動化；氣相色譜需要特殊和更靈敏的檢測裝置，這促進了檢測器的開發(fā)；而氣相色譜的標準化又使得色譜學(xué)理論得以形成色譜學(xué)理論中有著重要地位的塔板理論和Van Deemter方程，以及保留時間、保留指數(shù)、峰寬等概念都是在研究氣相色譜行為的過程中形成的。
高效液相色譜
1960年代，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易汽化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動流動相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。
1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實踐》一書，標志著高效液相色譜法 （HPLC）正式建立。在此后的時間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。
分類
按兩相狀態(tài)
氣相色譜法
.氣固色譜法
.氣液色譜法
液相色譜法
.液固色譜法
.液液色譜法
按固定相的幾何形式
.柱色譜法(column chromatography)
柱色譜法是將固定相裝在一金屬或玻璃柱中或是將固定相附著在毛細管內(nèi)壁上做成色譜柱，試樣從柱頭到柱尾沿一個向移動而進行分離的色譜法。
.紙色譜法（paper chromatography）
紙色譜法是利用濾紙作固定液的載體，把試樣點在濾紙上，然后用溶劑展開，各組分在濾紙的不同位置以斑點形式顯現(xiàn)，根據(jù)濾紙上斑點位置及大小進行定性和定量分析。
.薄層色譜法(thin-layer chromatography, TLC)
薄層色譜法是將適當(dāng)粒度的吸附劑作為固定相涂布在平板上形成薄層，然后用與紙色譜法類似的方法操作以達到分離目的。
按分離原理
按色譜法分離所依據(jù)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)的不同，又可將其分為：
吸附色譜法：利用吸附劑表面對不同組分物理吸附性能的差別而使之分離的色譜法稱為吸附色譜法。適于分離不同種類的化合物（例如，分離醇類與芳香烴）。
分配色譜法：利用固定液對不同組分分配性能的差別而使之分離的色譜法稱為分配色譜法。
離子交換色譜法：利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法，利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實現(xiàn)分離。離子交換色譜主要是用來分離離子或可離解的化合物。它不僅廣泛地應(yīng)用于無機離子的分離，而且廣泛地應(yīng)用于有機和生物物質(zhì)，如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等的分離。
尺寸排阻色譜法：是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法，體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本按其分子大小先后排阻，從柱中流出。被廣泛應(yīng)用于大分子分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。
親和色譜法：相互間具有高度特異親和性的二種物質(zhì)之一作為固定相，利用與固定相不同程度的親和性，使成分與雜質(zhì)分離的色譜法。例如利用酶與基質(zhì)（或抑制劑）、抗原與抗體，激素與受體、外源凝集素與多糖類及核酸的堿基對等之間的專一的相互作用，使相互作用物質(zhì)之一方與不溶性擔(dān)體形成共價結(jié)合化合物，用來作為層析用固定相，將另一方從復(fù)雜的混合物中選擇可逆地截獲，達到純化的目的。可用于分離活體高分子物質(zhì)、過濾性病毒及細胞?；蛴糜趯μ禺惖南嗷プ饔眠M行研究?！ ?/p>
原理
色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會不同，這使其隨流動相運動速度各不相同，隨著流動相的運動，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。根據(jù)物質(zhì)的分離機制，又可以分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等類別?！ ?/p>
吸附色譜
吸附色譜利用固定相吸附中心對物質(zhì)分子吸附能力的差異實現(xiàn)對混合物的分離，吸附色譜的色譜過程是流動相分子與物質(zhì)分子競爭固定相吸附中心的過程
吸附色譜的分配系數(shù)表達式如下：
K_a =\frac｛[X_a]｝｛[X_m]｝
其中[Xa]表示被吸附于固定相活性中心的組分分子含量，[Xm]表示游離于流動相中的組分分子含量。分配系數(shù)對于計算待分離物質(zhì)組分的保留時間有很重要的意義?！ ?/p>
分配色譜
分配色譜利用固定相與流動相之間對待分離組分溶解度的差異來實現(xiàn)分離。分配色譜的固定相一般為液相的溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者擔(dān)體表面。分配色譜過程本質(zhì)上是組分分子在固定想和流動相之間不斷達到溶解平衡的過程。
分配色譜的狹義分配系數(shù)表達式如下：
K=\frac=\frac｛X_s/V_s｝｛X_m/V_m｝
式中Cs代表組分分子在固定相液體中的溶解度，Cm代表組分分子在流動相中的溶解度。
離子交換色譜
離子色譜分析法出現(xiàn)在20世紀70年代，80年代迅速發(fā)展起來，以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象。
離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實現(xiàn)分離。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結(jié)構(gòu)中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發(fā)生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，并隨著流動相的運動而運動，最終實現(xiàn)分離。
離子交換色譜的分配系數(shù)又叫做選擇系數(shù)，其表達式為：
K_s=\frac｛[RX^+]｝｛[X^+]｝
其中[RX + ]表示與離子交換樹脂活性中心結(jié)合的離子濃度，[X + ]表示游離于流動相中的離子濃度?！ ?/p>
凝膠色譜
凝膠色譜的原理比較特殊，類似于分子篩。待分離組分在進入凝膠色譜后，會依據(jù)分子量的不同，進入或者不進入固定相凝膠的孔隙中，不能進入凝膠孔隙的分子會很快隨流動相洗脫，而能夠進入凝膠孔隙的分子則需要更長時間的沖洗才能夠流出固定相，從而實現(xiàn)了根據(jù)分子量差異對各組分的分離。調(diào)整固定相使用的凝膠的交聯(lián)度可以調(diào)整凝膠孔隙的大??；改變流動相的溶劑組成會改變固定相凝膠的溶漲狀態(tài)，進而改變孔隙的大小，獲得不同的分離效果?！ ?/p>
吸附色譜
吸附色譜利用固定相吸附中西對物質(zhì)分子吸附能力的差異實現(xiàn)對混合物的分離，吸附色譜的色譜過程是流動相分子與物質(zhì)分子競爭固定相吸附中心的過程?！ ?/p>
基本原理
（1）物理吸附又稱表面吸附，是因構(gòu)成溶液的分子（含溶質(zhì)及溶劑）與吸附劑表面分子的分子間里的相互作用所引起的。
a) 基本規(guī)律：“相似者易于吸附”，固液吸附時，吸附劑、溶質(zhì)、溶劑三者統(tǒng)稱為吸附過程的三要素。
b) 基本特點：無選擇性、可逆吸附、快速。
c) 基本原理：吸附與解吸附的往復(fù)循環(huán)。
d) 三要素：吸附劑、溶質(zhì)(被分離物)、溶劑。
色譜柱
物理吸附過程：吸附——解吸附——再吸附——再解析——直至分離
（2）化學(xué)吸附
a) 基本特點：有選擇性、不可逆吸附。
b) 基本原理：產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)與Al2O3發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；堿性物質(zhì)與硅膠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；Al2O3容易發(fā)生結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化，應(yīng)盡量避免。
（3）半化學(xué)吸附
1）基本特點：介于物理吸附和化學(xué)吸附之間。
2）基本原理：以氫鍵的形式產(chǎn)生吸附。
如聚酰胺對黃酮類、醌類等化合物之間的氫鍵吸附，力量較弱，介于前兩者之間，也有一定的應(yīng)用?！ ?/p>
吸附劑
吸附劑的一般要求：較大的表面積與一定的吸附能力。不與展開劑其化學(xué)變化，不與待分離的物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)或催化、分解或締合，顆粒均勻。
（1）極性吸附劑
硅膠，氧化鋁均為極性吸附劑，特點為：
a) 對極性物質(zhì)具有較強的親和能力，極性強的溶質(zhì)將被優(yōu)先吸附。
b) 溶劑極性較弱，則吸附劑對溶質(zhì)將表現(xiàn)出較強的吸附能力。溶劑極性增強，則吸附劑對溶質(zhì)的吸附能力隨之減弱。
c) 溶質(zhì)即使被硅膠、氧化鋁吸附，但一旦加入極性較強的溶劑時，又可被后者置換洗脫下來。
極性強弱的判斷 (與功能基的種類、數(shù)目多少和排列方式有關(guān)) ：親水性基團與極性成正比，親脂性基團與極性成反比；游離型化合物極性弱、具親脂性，解離型化合物極性強、具親水性；溶劑的極性—依據(jù)介電常數(shù)來決定。
色譜試劑
（2）聚酰胺
聚酰胺吸附劑可分包括錦綸6（聚己內(nèi)酰胺）和錦綸66（聚己二酰己二胺），為氫鍵吸附，半化學(xué)吸附。聚酰胺分子中有許多酰胺基，聚酰胺上的C=O與酚基，黃酮類、酸類中的-OH或-COOH形成氫鍵。酰胺基中的氨基與醌類或硝基類化合物中的醌基或硝基形成氫鍵。由于被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，或同一類結(jié)構(gòu)化合物中的活性基團的數(shù)目及位置的不同而是之于聚酰胺形成氫鍵的能力不同而得到分離。
（3）活性炭
活性炭為非極性吸附劑，故與硅膠、氧化鋁相反，對非極性物質(zhì)具有較強的親和能力，在水中對溶質(zhì)表現(xiàn)出強的吸附能力。溶劑極性降低，則活性炭對溶質(zhì)的吸附能力也隨之降低。吸附劑的吸附力一定時，溶質(zhì)極性越強，洗脫劑的極性越弱。
操作方式
吸附薄層色譜法是指根據(jù)各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在移動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）的過程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達到各成分的互相分離的目的。
色譜理論
關(guān)于保留時間的理論
保留時間是樣品從進入色譜柱到流出色譜柱所需要的時間，不同的物質(zhì)在不同的色譜柱上以不同的流動相洗脫會有不同的保留時間，因此保留時間是色譜分析法比較重要的參數(shù)之一。
保留時間由物質(zhì)在色譜中的分配系數(shù)決定：
tR = t0(1 + KVs / Vm)
式中tR表示某物質(zhì)的保留時間，t0是色譜系統(tǒng)的死時間，即流動相進入色譜柱到流出色譜柱的時間，這個時間由色譜柱的孔隙、流動相的流速等因素決定。K為分配系數(shù)，VsVm表示固定相和流動相的體積。這個公式又叫做色譜過程方程，是色譜學(xué)最基本的公式之一。
在薄層色譜中沒有樣品進入和流出固定相的過程，因此人們用比移值標示物質(zhì)的色譜行為。比移值是一個與保留時間相對應(yīng)的概念，它是樣品點在色譜過程中移動的距離與流動相前沿移動距離的比值。與保留時間一樣，比移值也由物質(zhì)在色譜中的分配系數(shù)決定：
R_f=\frac｛V_m+KV_s｝
其中Rf是比移值，K表示色譜分配系數(shù)，VsVm表示固定相和流動相的體積?！ ?/p>
基于熱力學(xué)的塔板理論
塔板理論是色譜學(xué)的基礎(chǔ)理論，塔板理論將色譜柱看作一個分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動，在每一個塔板內(nèi)組分分子在固定相和流動相之間形成平衡，隨著流動相的流動，組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板，并不斷形成新的平衡。一個色譜柱的塔板數(shù)越多，則其分離效果就越好。
根據(jù)塔板理論，待分離組分流出色譜柱時的濃度沿時間呈現(xiàn)二項式分布，當(dāng)色譜柱的塔板數(shù)很高的時候，二項式分布趨于正態(tài)分布。則流出曲線上組分濃度與時間的關(guān)系可以表示為：
C_t=\frac｛\sigma\sqrt｛2\pi｝｝ e^｛-\frac｛(t-t_R)^2｝｛2\sigma^2｝｝
這一方程稱作流出曲線方程，式中Ct為t時刻的組分濃度；C0為組分總濃度，即峰面積；σ為半峰寬，即正態(tài)分布的標準差；tR為組分的保留時間。
根據(jù)流出曲線方程人們定義色譜柱的理論塔板高度為單位柱長度的色譜峰方差：
H=\frac｛\sigma^2｝
理論塔板高度越低，在單位長度色譜柱中就有越高的塔板數(shù)，則分離效果就越好。決定理論塔板高度的因素有：固定相的材質(zhì)、色譜柱的均勻程度、流動相的理化性質(zhì)以及流動相的流速等。
塔板理論是基于熱力學(xué)近似的理論，在真實的色譜柱中并不存在一片片相互隔離的塔板，也不能完全滿足塔板理論的前提假設(shè)。如塔板理論認為物質(zhì)組分能夠迅速在流動相和固定相之間建立平衡，還認為物質(zhì)組分在沿色譜柱前進時沒有徑向擴散，這些都是不符合色譜柱實際情況的，因此塔板理論雖然能很好地解釋色譜峰的峰型、峰高，客觀地評價色譜柱地柱效，卻不能很好地解釋與動力學(xué)過程相關(guān)的一些現(xiàn)象，如色譜峰峰型的變形、理論塔板數(shù)與流動相流速的關(guān)系等。
基于動力學(xué)的范第姆特方程
范第姆特方程（Van Deemter equation）是對塔板理論的修正，用于解釋色譜峰擴張和柱效降低的原因。塔板理論從熱力學(xué)出發(fā)，引入了一些并不符合實際情況的假設(shè)，Van Deemter方程則建立了一套經(jīng)驗方程來修正塔板理論的誤差。
范第姆特方程將峰形的改變歸結(jié)為理論塔板高度的變化，理論塔板高度的變化則源于若干原因，包括渦流擴散、縱向擴散和傳質(zhì)阻抗等。
由于色譜柱內(nèi)固定相填充的不均勻性，同一個組分會沿著不同的路徑通過色譜柱，從而造成峰的擴張和柱效的降低。這稱作渦流擴散
縱向擴散是由濃度梯度引起的，組分集中在色譜柱的某個區(qū)域會在濃度梯度的驅(qū)動下沿著徑向發(fā)生擴散，使得峰形變寬柱效下降。
傳質(zhì)阻抗本質(zhì)上是由達到分配平衡的速率帶來的影響。實際體系中，組分分子在固定相和流動相之間達到平衡需要進行分子的吸附、脫附、溶解、擴散等過程，這種過程稱為傳質(zhì)過程，阻礙這種過程的因素叫做傳質(zhì)阻抗。在理想狀態(tài)中，色譜柱的傳質(zhì)阻抗為零，則組分分子流動相和固定相之間會迅速達到平衡。在實際體系中傳質(zhì)阻抗不為零，這導(dǎo)致色譜峰擴散，柱效下降。
在氣相色譜中Van Deemter方程形式為：
H=A+\frac｛\mu｝+C\mu
其中H為塔板數(shù)，A為渦流擴散系數(shù)，B為縱向擴散系數(shù)，C為傳質(zhì)阻抗系數(shù)，μ為流動相流速。
在高效液相色譜中，由于流動相粘度遠遠高于氣相色譜，縱向擴散對峰型的影響很小，可以忽略不計算，因而Van Deemter方程的形式為：
H = A + Cμ
技術(shù)與方法
色譜法常見的方法有：柱色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等?！ ?/p>
柱色譜
柱色譜法是最原始的色譜方法，這種方法將固定相注入下端塞有棉花或濾紙的玻璃管中，將被樣品飽和的固定相粉末攤鋪在玻璃管頂端，以流動相洗脫。常見的洗脫方式有兩種，一種是自上而下依靠溶劑本身的重力洗脫，一種是自下而上依靠毛細作用洗脫。收集分離后的純凈組分也有兩種不同的方法，一種方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一種方法是烘干固定相后用機械方法分開各個色帶，以合適的溶劑浸泡固定相提取組分分子。柱色譜法被廣泛應(yīng)用于混合物的分離，包括對有機合成產(chǎn)物、天然提取物以及生物大分子的分離。
薄層色譜
薄層色譜法是應(yīng)用非常廣泛的色譜方法，這種色譜方法將固定相圖布在金屬或玻璃薄板上形成薄層，用毛細管、鋼筆或者其他工具將樣品點染于薄板一端，之后將點樣端浸入流動相中，依靠毛細作用令流動相溶劑沿薄板上行展開樣品。薄層色譜法成本低廉操作簡單，被用于對樣品的粗測、對有機合成反應(yīng)進程的檢測等用途。
氣相色譜
氣相色譜是機械化程度很高的色譜方法，氣相色譜系統(tǒng)由氣源、色譜柱和柱箱、檢測器和記錄器等部分組成。氣源負責(zé)提供色譜分析所需要的載氣，即流動相，載氣需要經(jīng)過純化和恒壓的處理。氣相色譜的色譜柱一般直徑很細長度很長，根據(jù)結(jié)構(gòu)可以分為填充柱和毛細管柱兩種，填充柱比較短粗，直徑在5毫米左右，長度在2-4米間，外殼材質(zhì)一般為不銹鋼，內(nèi)部填充固定相填料；毛細管柱由玻璃或石英制成，內(nèi)徑不超過0.5毫米，長度在數(shù)十米到一百米之間，柱內(nèi)或者填充填料或者圖布液相的固定相。柱箱是保護色譜柱和控制柱溫度的裝置，在氣相色譜中，柱溫常常會對分離效果產(chǎn)生很大影響，程序性溫度控制常常是達到分離效果所必須的，因此柱箱扮演了非常重要的角色。檢測器是氣相色譜帶給色譜分析法的新裝置，在經(jīng)典的柱色譜和薄層色譜中，對樣品的分離和檢測是分別進行的，而氣相色譜則實現(xiàn)了分離與檢測的結(jié)合，隨著技術(shù)的進步，氣相色譜的檢測器已經(jīng)有超過30種不同的類型。記錄器是記錄色譜信號的裝置，早期的氣相色譜使用記錄紙和記錄器進行記錄，現(xiàn)在記錄工作都已經(jīng)依靠計算機完成，并能對數(shù)據(jù)進行實時的化學(xué)計量學(xué)處理。氣相色譜被廣泛應(yīng)用于小分子量復(fù)雜組分物質(zhì)的定量分析?！ ?/p>
高效液相色譜
高效液相色譜 （HPLC）是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn)；進樣系統(tǒng)要求進樣便利切換嚴密；由于液體流動相粘度遠遠高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領(lǐng)域?！ ?/p>
應(yīng)用
色譜法的應(yīng)用可以根據(jù)目的分為制備性色譜和分析性色譜兩大類。
制備性色譜的目的是分離混合物，獲得一定數(shù)量的純凈組分，這包括對有機合成產(chǎn)物的純化、天然產(chǎn)物的分離純化以及去離子水的制備等。相對于色譜法出現(xiàn)之前的純化分離技術(shù)如重結(jié)晶，色譜法能夠在一步操作之內(nèi)完成對混合物的分離，但是色譜法分離純化的產(chǎn)量有限，只適合于實驗室應(yīng)用。
分析性色譜的目的是定量或者定性測定混合物中各組分的性質(zhì)和含量。定性的分析性色譜有薄層色譜、紙色譜等，定量的分析性色譜有氣相色譜、高效液相色譜等。色譜法應(yīng)用于分析領(lǐng)域使得分離和測定的過程合二為一，降低了混合物分析的難度縮短了分析的周期，是目前比較主流的分析方法。在中華人民共和國藥典中，共有超過約600種化學(xué)合成藥和超過約400種中藥的質(zhì)量控制應(yīng)用了高效液相色譜的方法?！ ?/p>
發(fā)展方向
色譜法是分析化學(xué)中應(yīng)用最廣泛發(fā)展最迅速的研究領(lǐng)域，新技術(shù)新方法層出不窮。
新固定相的研究
固定相和流動相是色譜法的主角，新固定相的研究不斷擴展著色譜法的應(yīng)用領(lǐng)域，如手性固定相使色譜法能夠分離和測定手性化合物；反相固定相沒有死吸附，可以簡單地分離和測定血漿等生物藥品?！ ?/p>
檢測方法的研究
檢測方法也是色譜學(xué)研究的熱點之一，人們不斷更新檢測器的靈敏度，使色譜分析能夠更靈敏地進行分析。人們還將其他光譜的技術(shù)引入色譜，如進行色譜－質(zhì)譜連用、色譜－紅外光譜連用、色譜－紫外連用等，在分離化合物的同時即行測定化合物的結(jié)構(gòu)。色譜檢測器的發(fā)展還伴隨著數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展，檢測獲得的數(shù)據(jù)隨即進行計算處理，使試驗者獲得更多信息。
專家系統(tǒng)
專家系統(tǒng)是色譜學(xué)與信息技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，由于應(yīng)用色譜法進行分析要根據(jù)研究內(nèi)容選擇不同的流動相、固定相、預(yù)處理方法以及其他條件，因此需要大量的實踐經(jīng)驗，色譜專家系統(tǒng)是模擬色譜專家的思維方式為色譜使用者提供幫助的程序，專家系統(tǒng)的知識庫中存儲了大量色譜專家的實踐經(jīng)驗，可以為使用者提供關(guān)于色譜柱系統(tǒng)選擇、樣品處理方式、色譜分離條件選擇、定性和定量結(jié)果解析等幫助。
色譜新方法
色譜新方法也是色譜研究熱點之一。高效毛細管電泳法是目前研究最多的色譜新方法，這種方法沒有流動相和固定相的區(qū)分，而是依靠外加電場的驅(qū)動令帶電離子在毛細管中沿電場方向移動，由于離子的帶電狀況、質(zhì)量、形態(tài)等的差異使不同離子相互分離。高效毛細管電泳法沒有HPLC方法中存在的傳質(zhì)阻抗、渦流擴散等降低柱效的因素，縱向擴散也因為毛細管壁的雙電層的存在而受到抑制，因而能夠達到很高的理論塔板數(shù)，有極好的分離效果。
《色譜》期刊介紹
《色譜》期刊是中國化學(xué)會主辦、中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所和國家色譜研究分析中心承辦 、科學(xué)出版社出版的專業(yè)性學(xué)術(shù)期刊，于1984年創(chuàng)刊，國內(nèi)外公開發(fā)行。重點報道色譜學(xué)科的學(xué)術(shù)理論，色譜儀器與部件的研制開發(fā)，色譜及其相關(guān)技術(shù)在石油、煤炭、化工、能源、冶金、輕工、食品、制藥、化學(xué)、生化、醫(yī)療、環(huán)保、
防疫、公安、農(nóng)業(yè)、商檢等領(lǐng)域應(yīng)用的原始性、創(chuàng)新性科研成果。 《色譜》設(shè)有研究論文、研究快報、專論與綜述和技術(shù)與應(yīng)用等多種欄目，不定期刊登有關(guān)色譜領(lǐng)域熱點及重點的專題論文，并載有色譜方面的書訊、國內(nèi)學(xué)術(shù)活動簡訊 （包括會議征文及報道）等內(nèi)容。 適于廣大分析工作者及大專院校師生閱讀，也是圖書 、情報部門必備資料。
研究論文：報道有創(chuàng)新性、學(xué)術(shù)水平較高或社會效益較大的完整的重要研究成果。
及有一定特色的科研成 果，或反映研究工作的部分或階段性成果。
研究快報：扼要報道創(chuàng)新性顯著、具有首報意義的的研究成果。
專論與綜述：以自己的研究工作為基礎(chǔ)，對當(dāng)前國內(nèi)外色譜學(xué)科新理論、新方法、新技術(shù)及其相關(guān)技術(shù)的最
新研究進展、科研動向及應(yīng)用成果進行綜述或評論。
技術(shù)與應(yīng)用：報道新技術(shù)、新裝置的開發(fā)與應(yīng)用及對前人方法的革新和改進。重點介紹實驗方法和結(jié)果、結(jié)
論。
《色譜》現(xiàn)已被十余種國內(nèi)外主要檢索刊物和數(shù)據(jù)庫收錄，它們是：美國《化學(xué)文摘》（CA）、俄羅斯《文
摘雜志》（AJ）、 英國《分析文摘》（AA）、美國《醫(yī)學(xué)索引》（IM）、美國劍橋科學(xué)文摘（CSA）、波蘭哥白尼索引(Index Copernicus)以及《中國學(xué)術(shù)期刊文摘》、 《中國學(xué)術(shù)期刊（光盤版）》 、 《中國學(xué)術(shù)期刊綜合評價數(shù)據(jù)庫》 、 《萬方數(shù)據(jù)資源系統(tǒng)（ChinaInfo）數(shù)字化期刊群》、 《中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫》、 《中國核心期刊要目總覽》、《中國科技論文統(tǒng)計與分析》、《中國期刊全文數(shù)據(jù)庫》、《中國生物學(xué)文摘》、《中國生物學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫》等。
據(jù)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所編寫的2007年版 《中國科技期刊引證報告》（統(tǒng)計源為1723種期刊）最新報道：
2006年《色譜》的影響因子為0.608。
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