單克隆抗體
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抗體是由B淋巴細(xì)胞分化形成的漿細(xì)胞合成、分泌的。每一個B淋巴細(xì)胞在成熟的過程中通過隨機(jī)重排只產(chǎn)生識別一個抗原的抗原受體基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時，抗原分子上的許多抗原決定簇分別激活各個具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體?！ ?/p>
目錄 |
單克隆抗體技術(shù)的基本原理
要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長。而實驗發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來源于單個融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。
單克隆抗體是僅由一種類型的細(xì)胞制造出來的抗體，對應(yīng)于多克隆抗體/多株抗體——由多種類型的細(xì)胞制造出來的一種抗體。
單克隆抗體由可以制造這種抗體的免疫B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后的細(xì)胞產(chǎn)生的，這種融合細(xì)胞即具有瘤細(xì)胞不斷分裂的能力，又具有免疫細(xì)胞能產(chǎn)生抗體的能力。融合后的雜交細(xì)胞(雜種瘤)可以產(chǎn)生大量相同的抗體。當(dāng)其應(yīng)用于醫(yī)療中時，在識別抗原中的顯示的微小變化(如果有的話)有助于減小副作用。
1975年，德國科學(xué)家喬治.克勒和阿根廷科學(xué)家凱撤.米爾斯坦，把產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，形成雜交瘤細(xì)胞。這種細(xì)胞兼有兩個親代細(xì)胞的特征，既有骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的能力，又有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。因此，這種雜交瘤細(xì)胞就能在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生大量單一類型的高純度抗體。這種抗體叫“單克隆抗體”。
單抗隆抗體的制備
雜交瘤細(xì)胞的大量繁殖
克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細(xì)胞就開始無限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的100~1 000倍。
利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血清等，可以加速和促進(jìn)腫瘤的生長。
1．材料
2．操作方法
- 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周內(nèi)種植細(xì)胞。
- 收取對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，用５％FCS—1640液洗滌一次，1 000r/min離心10min。
- 取樣，用臺盼蘭染色，計活細(xì)胞數(shù)，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107細(xì)胞/ml的懸液。
- 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107個細(xì)胞/ml）。
- 接種后10天左右時間腫瘤體積最大，此時可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下動脈或心臟采血后分離。
單克隆抗體的提純
1．材料
- 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液,20 mMol/L NaCl
- 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液,40mMol/L NaCl
- 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液,80 mMol/L NaCl
- 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
- 飽和硫酸銨液
- DEAE—纖維素柱
2．操作方法
- 小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00×105轉(zhuǎn)離心30min，去沉淀。
- 在4℃于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使溶液最終為50％硫酸銨濃度。
- 此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min離心10min，去上清。
- 將沉淀溶于Tris－HCl緩沖液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混濁）。
- 裝入透析袋于Tris－HCl緩沖液（20 mMol/L NaCl）中透析除鹽。
- 離心去沉淀。
- 溶液稀釋（1:100或更高倍稀釋）后，于280nm測蛋白含量，估計蛋白質(zhì)含量. 1A 280unit=0.8mg蛋白質(zhì)。一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg~36mg。
- 過DEAE—纖維素柱：纖維素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。
樣品進(jìn)入柱床速度為1ml~2ml/min，以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫。
測OD280nm收集蛋白峰，單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?/p>
雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細(xì)胞。免疫多次的多為IgG。
單克隆抗體的鑒定
- 雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查 采用秋水仙素裂解法進(jìn)行。
- 單克隆抗體的類型、亞型的測定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，采用瓊脂擴(kuò)散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。
- 單抗的特異性鑒定 可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等，同時還需做免疫阻斷試驗等。
- 單抗的效價測定 可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同。培養(yǎng)上清液的效價遠(yuǎn)不如腹水的效價。采用凝集反應(yīng)，腹水效價可達(dá)5×104。而采用ELISA檢查，腹水效價可達(dá)1.0×106。單抗的效價以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示。
- 必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定?！ ?/li>
醫(yī)學(xué)用途
把單克隆抗體與抗癌藥物或毒素結(jié)合起來，就成為威力強(qiáng)大的抗體“生物導(dǎo)彈”。把這種抗體“導(dǎo)彈”注射到癌癥患者的血液中，它就會發(fā)揮導(dǎo)彈樣的作用，在患者體內(nèi)追蹤并附著于癌細(xì)胞上，然后與抗體結(jié)合的抗癌藥物或毒素殺傷和破壞癌細(xì)胞，而且很少損傷正常組織細(xì)胞。這種抗體“導(dǎo)彈”具有高度選擇性，對癌細(xì)胞命中率高，殺傷力強(qiáng)的優(yōu)點，沒有一般化學(xué)藥物那樣不分好壞細(xì)胞，格殺勿論的缺點。美國約翰.霍普金斯醫(yī)院應(yīng)用抗體“導(dǎo)彈”治療晚期肝癌病人，收到驚人效果。肝臟腫癌顯著縮小，生存期延長，而且沒有副作用。單克隆抗體技術(shù)的發(fā)明，是免疫學(xué)中的一次革命，打破了過去只能在身體內(nèi)產(chǎn)生抗體的方法，而成功地在體外用細(xì)胞培養(yǎng)的方法產(chǎn)生抗體，同時繁殖快，可以產(chǎn)生在體內(nèi)達(dá)不到的高滴度和高專一性的水平。它來自于每一個細(xì)胞，所以非常純凈。
單克隆抗體在疾病的診斷和治療預(yù)防方面，與常規(guī)的抗體相比，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性非常明顯，可利用此特性制成“生物導(dǎo)彈”用來運(yùn)送藥物至病害部位，主要是癌細(xì)胞。在生物導(dǎo)彈中，能識別抗原的單克隆抗體充當(dāng)瞄準(zhǔn)鏡，將抗癌藥物（彈頭）傳送到癌細(xì)胞，從而使抗癌藥物發(fā)揮藥效。
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