薄層色譜法
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薄層色譜法（TLC），系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點樣、展開后，根據(jù)比移值（Rf）與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比，用以進行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定的方法。薄層色譜法是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實驗技術(shù)，也用于跟蹤反應(yīng)進程。
目錄 |
簡介
薄層色譜，或稱薄層層析(thin—layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質(zhì)的特別有效的層析方法，從50年代發(fā)展起來至今，仍被廣泛采用?！ ?/p>
基本原理
薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在移動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）的過程中，連續(xù)的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達到各成分的互相分離的目的。
薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實驗中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。
吸附是表面的一個重要性質(zhì)。任何兩個相都可以形成表面，吸附就是其中一個相的物質(zhì)或溶解于其中的溶質(zhì)在此表面上的密集現(xiàn)象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發(fā)生吸附現(xiàn)象。
物質(zhì)分子之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子(離子或原子)和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不相等。在固體內(nèi)部，分子之間相互作用的力是對稱的，其力場互相抵消。而處于固體表面的分子所受的力是不對稱的，向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩余力的影響，就會被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動態(tài)平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡、吸附與解吸的動態(tài)平衡過程。
例如用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數(shù)的不同，使混合物得以分離。當(dāng)溶劑沿著吸附劑移動時，帶著樣品中的各組分起移動，同時發(fā)生連續(xù)吸附與解吸作用以及反復(fù)分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點。如作為標準的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據(jù)這些已知化合物的Rf值（后面介紹Rf值）對各斑點的組分進行鑒定，同時也可以進一步采用某些方法加以定量?！ ?/p>
比移值
Rf=溶質(zhì)移動的距離/溶液移動的距離。表示物質(zhì)移動的相對距離。
各種物質(zhì)的Rf 隨要分離化合物的結(jié)構(gòu)，濾紙或薄層板的種類、溶劑、溫度等不同而不同，但在條件固定的情況下，Rf對每一種化合物來說是一個特定數(shù)值?！ ?/p>
儀器與材料
(1) 載板
用以涂布薄層用的載板有玻璃板、鋁箔及塑料板，對薄層板的要求是：需要有一定的機械強度及化學(xué)惰性，且厚度均勻、表面平整，因此玻璃板是最常用的。載板可以有不同規(guī)格，但最大不得超過20×20，玻璃板在使用前必須洗凈、干燥備用。玻板除另有規(guī)定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的規(guī)格，要求光滑、平整，洗凈后不附水珠，晾干。
(2) 固定相（吸附劑）或載體
薄層層析硅膠薄層層析硅膠最常用的有硅膠G、硅膠GF〈[254]〉、硅膠H、硅膠HF〈[254]〉，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F〈[254]〉等。其顆粒大小，一般要求直徑為10～40μm。薄層涂布，一般可分無粘合劑和含粘合劑兩種；前者系將固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合劑，一般常用10～15％煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小時)，混勻后加水適量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液(0.5～0.7％)適量調(diào)成糊狀，均勻涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或緩沖液的薄層。
(3) 涂布器
應(yīng)能使固定相或載體在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。
(4) 點樣器
定性：內(nèi)徑為0.5mm管口平整的普通毛細管。
定量：微量注射劑。
點樣直徑不超過5mm，點樣距離一般為1~1.5cm即可。
(5) 展開室
應(yīng)使用適合載板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，并有嚴密的蓋子，除另有規(guī)定外，底部應(yīng)平整光滑，應(yīng)便于觀察。
操作
薄層板制備
除另有規(guī)定外，將1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動涂布器進行涂布（厚度為0.2～0.3mm），取下涂好薄層的玻板，置水平臺上于室溫下晾干，后在110℃烘30分鐘，即置有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。
手工制板一般分不含粘合劑的軟板和含粘合劑的硬板倆種。
常用吸附劑的基本情況：顆粒的大小，太大洗脫劑流速快分離效果不好，太細溶液流速太慢。一般說來吸附性強的顆粒稍大，吸附性弱的顆粒稍小。氧化鋁一般在100-150目。氧化鋁分為堿性氧化鋁，適用于碳氫化合物、生物堿及堿性化合物的分離，一般適用于PH為9-10的環(huán)境。中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、酯等PH約為7.5的中性物質(zhì)的分離。酸性氧化鋁適用于PH4~4.5的酸性有機酸類的分離。氧化鋁、硅膠根據(jù)活性分為五個級，一級活性最高，五級最低。
黏合劑及添加劑：為了使固定相（吸附劑）牢固地附著在載板上以增加薄層的機械強度，有利于操作，需要時在吸附劑中加入合適的黏合劑：有時為了特殊的分離或檢出需要，要在固定相中加入某些添加劑。
薄層板的活化：硅膠板于105-11℃烘30分鐘，氧化鋁板于150-160℃烘4小時，可得活性的薄層板?！ ?/p>
點樣
除另有規(guī)定外，用點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑及點間距離同紙色譜法,點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。
點樣直徑不超過5mm，點樣距離一般為1~1.5cm即可。
樣品在溶劑中的溶解度很大，原點將呈空心環(huán)——環(huán)形色譜效應(yīng)。因此配制樣品溶液時應(yīng)選擇對組分溶解度相對較小的溶劑。
點樣方式有點狀點樣和帶狀點樣。
展開
展開劑也稱溶劑系統(tǒng)，流動性或洗脫劑，是在平面色譜中用作流動相的液體。展開劑的主要任務(wù)是溶解被分離的物質(zhì)，在吸附劑薄層上轉(zhuǎn)移被分離物質(zhì)，使個組分的Rf值在0.2~0.8之間并對被分離物質(zhì)要有適當(dāng)?shù)倪x擇性。作為展開劑的溶劑應(yīng)滿足以下要求：適當(dāng)?shù)募兌取⑦m當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性、低黏度 、線性分配等溫線、很低或很高的蒸氣壓一級盡可能低的毒性。
展開方式總的來講平面色譜的展開有線性、環(huán)形及向心3種幾何形式。
A 單次展開 用同一種展開劑一個向展開一次，這種方式在平面色譜中應(yīng)用最為廣泛。（垂直上行展開，垂直下行展開，一向水平展開，對向水平展開）
B 多次展開 單向?qū)Υ苏归_，用相同的展開劑沿同一方向進行相同距離的重復(fù)展開，直至分離滿意，廣泛應(yīng)用于薄層色譜法
C 雙向展開 用于成分較多、性質(zhì)比較接近的難分離組分的分離。
薄層展開展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂?shù)纳w，使系統(tǒng)平衡或按正文規(guī)定操作。 將點好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0cm（切勿將樣點浸入展開劑中），密封室蓋，待展開至規(guī)定距離(一般為10～15cm)，取出薄層板，晾干，按各品種項下的規(guī)定檢測。
影響展開的因素
A 相對濕度的影響
B 溶劑蒸汽的影響（a 展開室的飽和 b預(yù)吸附）
C 溫度的影響
D 展距的影響 與分離度僅正比與展距的平方根?！ ?/p>
顯色
A 光學(xué)檢出法
a 自然光（400~800nm）
b 紫外光（254nm或365nm）
c 熒光 一些化合物吸收了較短波長的光，在瞬間發(fā)射出比照射光波長更長的光，而在紙或薄層上顯出不同顏色的熒光斑點（靈敏度高、專屬性高）
B 蒸汽顯色法
多數(shù)有機化合物吸附碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐色斑點，這種反應(yīng)有可逆及不可逆兩種情況，前者在離開碘蒸氣后，黃褐色斑點逐漸消退，并且不會改變化合物的性質(zhì)，且靈敏度也很高，故是定位時常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強了共軛體系，因此在紫外光下可以發(fā)出強烈而穩(wěn)定的熒光，對定性及定量都非常有利，但是制備薄層時要注意被分離的化合物是否改變了原來的性質(zhì)。
C 物理顯色法
用紫外照射分離后的紙或薄層后，使化合物產(chǎn)生光加成，光分解、光氧化還原及光異構(gòu)等光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如形成熒光發(fā)射功能團。發(fā)生熒光增強或淬滅及熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射波長發(fā)生移動等現(xiàn)象，從而提高了分析的靈敏度和選擇性。
D 試劑顯色法
廣泛應(yīng)用的定位方法。用于紙色譜的顯色劑一般都適用于薄層色譜，還有防腐劑的顯色劑不適合用于紙色譜及含有有機黏合劑薄層的顯色，又時噴顯色劑后續(xù)加熱，這也不是用于紙色譜。
顯色方法a噴霧顯色：顯色劑溶液以氣溶膠的形式均勻的噴灑在紙和薄層。 b 浸漬顯色：揮去展開劑的薄層板，垂直的插入盛有展開劑的浸漬槽中，設(shè)定浸板及抽出速度和規(guī)定在顯色劑中浸漬的時間。
顯色試劑
a 通用顯色劑 硫酸溶液（硫酸：水 1：1，硫酸：乙醇1：1）、0.5%碘的氯仿溶液、中性0.05%高錳酸鉀溶液、堿性高錳酸鉀溶液（還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色斑點）
b 專屬顯色劑
(5)測定比移值
在一定的色譜條件下，特定化合物的Rf值是一個常數(shù)，因此有可能根據(jù)化合物的Rf值鑒定化合物。
(6) 薄層掃描
薄層掃描法指用一定波長的光照射在經(jīng)薄層層析后的層析板上，對具有吸收或能產(chǎn)生熒光的層析斑點進行掃描，用反射法或透射法測定吸收的強度，以檢測層析譜。對于中成藥復(fù)方制劑，亦可用相應(yīng)的原藥材按需要組合作陰、陽對照，然后比較其薄層掃描圖譜加以鑒別。使用儀器為薄層掃描儀。
如需用薄層掃描儀對色譜斑點作掃描檢出，或直接在薄層上對色譜斑點作掃描定量，則可用薄層掃描法。 薄層掃描的方法，除另有規(guī)定外，可根據(jù)各種薄層掃描儀的結(jié)構(gòu)特點及使用說明，結(jié)合具體情況，選擇吸收法或熒光法，用雙波長或單波長掃描。由于影響薄層掃描結(jié)果的因素很多，故應(yīng)在保證供試品的斑點在一定濃度范圍內(nèi)呈線性的情況下，將供試品與對照品在同一塊薄層上展開后掃描，進行比較并計算定量，以減少誤差。各種供試品，只有得到分離度和重現(xiàn)性好的薄層色譜，才能獲得滿意的結(jié)果?！ ?/p>
應(yīng)用
食品和營養(yǎng)
食品中的營養(yǎng)成分是蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、油和脂肪、維生素、食用色素等。與食品和營養(yǎng)有害的物質(zhì)則有殘留農(nóng)藥、致癌的曲黃霉素等。這些成分都可用薄層色譜法定性和定量。蛋白質(zhì)和多肽水解為氨基酸，對不同來源的動物性和植物性蛋白水解后產(chǎn)生不同的氨基酸進行定性和定量，有助于解決蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和食品營養(yǎng)問題。二十多種氨基酸用硅膠G薄層板雙向展開，一次即能分開，然后定性和定量，方法快速而簡便。多糖和寡糖可水解為單糖，可用薄層色譜法進行單糖和雙糖的定性和定量。文獻上有每一個糖的Rf值和相應(yīng)的展開劑。油和脂肪解為脂肪酸，脂肪酸的種類和結(jié)構(gòu)中的不飽和鍵數(shù)，與營養(yǎng)和衛(wèi)生有關(guān)，關(guān)于油和脂肪的薄層（硅膠、硅藻土、纖維素)分析，文獻和綜述很多。脂溶性和水溶性維生素在薄層上可方便地定性和定量，例如脂溶性維生素A，D，E，K及B2，B6，B12，酶酸，泛酸，葉酸，C，促生素在硅膠G薄層上可用苯：甲醇：丙酮：冰醋酸（7:2:0.5:0.5）分開。用硅膠G薄層和丙酮：氯仿（1:1）以及激發(fā)波長365nm和波長450nm，可用熒光法測定ng量的曲黃素B1,B2,G1,G2,法靈敏快速。
藥物和藥物代謝
薄層色譜法在合成藥物和天然藥物中的應(yīng)用很廣。有些文獻和內(nèi)容偏重于合成藥物、化合物及其代謝產(chǎn)物，有文獻為在中草藥分析中的應(yīng)用。每一類藥物，例如磺胺、巴比妥、苯駢噻嗪、甾體激素、抗菌素、生物堿、強心甙、黃酮、揮發(fā)油和萜等，都包括幾種或十幾種化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似的化合物，可以在上述文獻中找出一、二種全盤的展開劑，一次即能把每一類的多種化合物很好地分開。藥物代謝產(chǎn)物的樣品一般先經(jīng)預(yù)處理后用薄層分析，應(yīng)用也很廣，但有時因含量甚微，不用采用氣相和高效液相色譜法靈敏?！ ?/p>
化學(xué)和化工
化工和化學(xué)方面的有機原料和產(chǎn)品都可用薄層色譜法分析。例如含各種功能基的有機物，石油產(chǎn)品，塑料單體，橡膠裂解產(chǎn)物，油漆原料，合成洗滌劑等，內(nèi)容非常廣泛。
醫(yī)學(xué)和臨床
薄層色譜法的應(yīng)用還滲透到醫(yī)學(xué)和臨床中去，例如它是一種快速的診斷方法可用于妊娠的早期診斷。方法是基于在孕婦的尿中能檢出比未媳婦婦女的尿中含更多的孕二醇，把兩者的尿提取后點在薄層上比較，即可作出判斷。這一方法可不用動物而在2~3小時內(nèi)化驗出結(jié)果。
毒物分析和法醫(yī)化學(xué)
如前所述，經(jīng)典的毒物分析有許多缺點，目前毒物分析和法醫(yī)化學(xué)采用薄層色譜法等新的手段，對麻醉藥、巴比妥、印度大麻、鴉片生物堿等均可分析?！ ?/p>
農(nóng)藥
十多種有機磷農(nóng)藥和六種有機氯農(nóng)藥都可在硅膠G薄層上分開并測定含量，可用于農(nóng)藥分析及其殘留量分析?！ ?/p>
優(yōu)點
薄層層析有許多優(yōu)點：它保持了操作方便、設(shè)備簡單、顯色容易等特點，同時展開速率快，一般僅需15～20分鐘；混合物易分離，分辨力一般比以往的紙層析高10～100倍，它既適用于只有0．01μg的樣品分離，又能分離大于500mg的樣品作制備用，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點是對生物高分子的分離效果不甚理想。
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