多酚氧化酶
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多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布極廣的一種金屬蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質(zhì)體中，甚至在土壤中腐爛的植物殘?jiān)隙伎梢詸z測到多酚氧化酶的活性。由于其檢測方便，是被最早研究的幾類酶之一。自1883年Yoghid發(fā)現(xiàn)日本漆樹液汁變硬可能和某種活性物質(zhì)相關(guān)，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和純化，得到多酚氧化酶并將這類酶稱為polyphenol oxidase。多酚氧化酶又稱兒茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，鄰苯二酚氧化還原酶，是六大類酶中的第一大類氧化還原酶。
多酚氧化酶的共同特征是能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對應(yīng)的醌。在廣義上，多酚氧化酶可分為三大類：單酚單氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在這三大類多酚氧化酶中，兒茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶?，F(xiàn)在大部分文獻(xiàn)所說的多酚氧化酶一般是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱?！ ?/p>
目錄 |
二、多酚氧化酶在自然界的分布
1植物中的多酚氧化酶及作用
在植物(如蘋果、荔枝、菠菜、馬鈴薯、豆類、茶葉、桑葉、煙草等)組織中，PPO是與內(nèi)囊體膜結(jié)合在一起的，天然狀態(tài)無活性，但將組織勻漿或損傷后PPO被活化，從而表現(xiàn)出活性。在果蔬細(xì)胞組織中，PPO存在的位置因原料的種類、品種及成熟度的不同而有差異，綠葉中PPO活性大部分存在于葉綠體內(nèi)[7]；馬鈴薯塊莖中幾乎所有的亞細(xì)胞部分都含有PPO，含量大約與蛋白質(zhì)部分相同[8]；在茶葉中的PPO分為游離態(tài)和束縛態(tài)，前者主要存在于細(xì)胞液中屬可溶態(tài)PPO，而后者則主要存在于葉綠體、線粒體等細(xì)胞器中，與這些細(xì)胞器的膜系統(tǒng)或其他特異部位結(jié)合呈不溶態(tài)[9]，ThanarajS.N.(1990)研究了茶樹新梢中PPO活性及多酚含量對紅茶品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)PPO活性強(qiáng)，多酚含量高，對紅茶品質(zhì)有利，相反則利于綠茶的生產(chǎn)[10]；新鮮的蘋果中，多酚氧化酶幾乎全部存在于葉綠體和線粒體中。從這兩部分分別制備的PPO，其底物專一性稍有差異[11]。劉乾剛認(rèn)為，PPO在細(xì)胞內(nèi)除了存在于葉綠體及線粒體上外，細(xì)胞壁也可能存在PPO，且對發(fā)酵產(chǎn)生影響，細(xì)胞只要輕微破損便有PPO的作用。多酚氧化酶是一種質(zhì)體酶，有些研究人員認(rèn)為多酚氧化酶可能僅存在于質(zhì)體中[12]，缺乏質(zhì)體的組織就不存在多酚氧化酶，例如篩管和篩胞等，但是有質(zhì)體的組織也可能沒有多酚氧化酶，如C4植物葉。含有質(zhì)體的植物組織不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有質(zhì)體的植物組織中。
隨分子生物學(xué)的發(fā)展，象西紅柿、蘋果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大學(xué)趙東等[12]對茶樹多酚氧化酶的克隆及其序列進(jìn)行了比較。從已經(jīng)克隆的多酚氧化酶的基因看，均屬于基因家族，多則6-7個(gè)基因。這些基因的表達(dá)具有時(shí)空差異和組織特異性（PPO在幼齡組織中表達(dá)，在成熟組織中不表達(dá)），表明多酚氧化酶的基因在植物中所起的作用不同。高等植物組織發(fā)生褐變主要是PPO作用的結(jié)果，PPO催化多酚氧化為醌，醌聚合并與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸反應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生黑色素沉淀。
2微生物中的多酚氧化酶
2.1微生物漆酶
漆酶是三大類多酚氧化酶中作用底物最廣的一類。漆酶最早是在1883年由Yoshida首先從漆樹液中發(fā)現(xiàn)的，后來人們又從大量的真菌體中發(fā)現(xiàn)了漆酶。漆酶來源很多，結(jié)構(gòu)各異，不同來源的漆酶表現(xiàn)出來的催化特性相差較大。即便是同一來源，如同一白腐菌菌種，也可分泌出不同性質(zhì)的漆酶組分，包括氧化能力、最適pH、底物專一性等，因此催化氧化作用也各不相同。漆酶分子中的銅離子是漆酶催化反應(yīng)的活性中心，在催化氧化過程中起決定作用。
在真菌中，漆酶大多分布在擔(dān)子菌(Basidimycetes)、多孔菌(Polyporus)、子囊菌(A-somycetes)、脈孢菌(Neurospora)、柄孢殼菌(Po-dospora)和曲霉菌(Aspergillus)等真菌中。擔(dān)子菌中的白腐菌是目前獲得漆酶的主要來源。Givaudan等還從稻根上的生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)中分離出細(xì)菌漆酶。
黃乾明等以粗毛栓菌(Trametes gallica )為出發(fā)菌，通過紫外誘變處理其擔(dān)抱子、PDA-RBBR平板變色法初篩、ABTS法測定培養(yǎng)液漆酶酶活力復(fù)篩，獲得1株漆酶高產(chǎn)誘變菌株SAH-12。
黃俊等(2006)從森林樹木根部土壤中分離得1株具有漆酶活性的細(xì)菌菌株，并鑒定該細(xì)菌屬于克雷伯氏菌(Klebsiella)屬，命名其為Klebsiella sp-601。這是首例報(bào)道Klebsiella細(xì)菌具有漆酶活性。
2.2.微生物酪氨酸酶
酪氨酸酶，又叫單酚氧化酶，它可以氧化L-酪氨酸合成L-多巴和黑色素。在高等動(dòng)物和人類中酪氨酸酶的活性高低與黑色素的形成速率有關(guān)，缺乏此酶活性將引起白化病。
有報(bào)道說，一種假單胞菌(Pseudomonas sp.)具有高產(chǎn)酪氨酸酶的能力，另一種細(xì)菌即弗氏檸檬桿菌(Cibrobacter freundii)在L一酪氨酸誘導(dǎo)下能高效表達(dá)酪氨酸酶的催化活性，經(jīng)小試試驗(yàn)可獲得L-多巴產(chǎn)量9.5g/L，為其中試生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
蔡信之等分離并鑒定出嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia)AT18能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生酪氨酸酶，并催化產(chǎn)生黑色素。他們已將該菌的酪氨酸酶基因(mel)片斷克隆到E.coli質(zhì)粒載體pUC18上，構(gòu)建了產(chǎn)生黑色素的工程菌E.coli/pwSY?！ ?/p>
三、多酚氧化酶的研究現(xiàn)狀及展望
1植物PPO的研究現(xiàn)狀及展望
PPO與抗病性的關(guān)系人們已進(jìn)行了廣泛的研究[32]。植物在抵御病原微生物的侵染過程中，抗性相關(guān)酶發(fā)揮了重要作用，這主要包括了酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶和病原相關(guān)蛋白家族PPO通過催化木質(zhì)素及醌類化合物形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽而使細(xì)胞免受病菌的侵害，也可以通過形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用。目前已比較成功的有:黃瓜對黑星病的抗性，蘋果對輪紋病的抗性，香蕉對束頂病的抗性，檸檬對流膠病的抗性，甘薯對蔓割病的抗性，水稻對白葉枯病的抗性等等。
茶葉中所有化學(xué)成分中，兒茶素與多酚氧化酶尤為重要，除綠茶、黃茶外，各種茶葉的加工都是基于兒茶素在多酚氧化酶催化下的氧化作用，即所謂的“發(fā)酵”過程。有的學(xué)者在紅碎茶加工中，利用茶幼果作為外源PPO的載體，以一定比例用于紅碎茶加工過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能明顯提高成茶的TF含量，減少TB含量。還有的學(xué)者進(jìn)行了內(nèi)源酶發(fā)酵研究，以期望能在茶飲料中有所應(yīng)用，改善滋味。
多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐變的主要酶類，PPO催化果蔬原料中的內(nèi)源性多酚物質(zhì)氧化生成黑色素，嚴(yán)重影響制品的營養(yǎng)，風(fēng)味及外觀品質(zhì)。這些情況對生產(chǎn)者與消費(fèi)者均是不希望看到的，僅在少數(shù)幾種食品的生產(chǎn)中，人們利用了PPO的作用，如茶葉、咖啡、黑葡萄中的多酚氧化酶?！ ?/p>
2微生物PPO的研究現(xiàn)狀及展望
隨著微生物發(fā)酵投人少、見效快、易控制等特點(diǎn)的凸顯，開發(fā)微生物中的多酚氧化酶成了研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。微生物中的漆酶對氧化酚類或芳胺類等多種底物的氧化起催化作用，從而使其在含酚廢水的處理、環(huán)境中酚類毒物的降解、飲料加工、食用和藥用菌生產(chǎn)、飼料工業(yè)及醫(yī)藥衛(wèi)生等各個(gè)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[33]。而利用微生物發(fā)酵合成酪氨酸酶也已成為研制治療白癱風(fēng)、帕金森病和老年癡呆癥等疾患藥物的努力方向。
由于自然界中存在著大量結(jié)構(gòu)不同的多酚類物質(zhì)，而催化這些酚類物質(zhì)氧化的多酚氧化酶也是不同的。如果從微生物中篩選出有效的酶源或者利用酶修飾、基因異源表達(dá)和基因工程菌的構(gòu)建等技術(shù)創(chuàng)造出有效的微生物酶源，這將著深遠(yuǎn)意義。
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