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臨床生物化學(xué)

血漿蛋白及其代謝紊亂 載脂蛋白 載脂蛋白組成與結(jié)構(gòu)特點及生理功用 載脂蛋白的基因結(jié)構(gòu)及表型

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Apo種類很多，一般分為5-7類，其氨基酸序列大多數(shù)已闡明，Apo種類的命名是按1972年Alaupovic建議的命名方法，用英文字母順序編碼，即ABC順，每一類還有亞類。

（一）載脂蛋白A族

ApoA可分為ApoAⅠ，AⅡ,AⅣ。ApoAⅠ和AⅡ大部分分布在HDL中，是HDL的主要載脂蛋白。

1.ApoAⅠApoAⅠ是ApoA族最多的一種組份，先后從人HDL中分離純化得到ApoAⅠ，并闡明了ApoAⅠ的氨基酸序列，也預(yù)測了其二級結(jié)構(gòu)的要點。人成熟的ApoAⅠ由243個氨基酸殘基組成，是單一多肽鏈，分子量為28.3ku。人及大鼠、猴、兔、牛、鴨、樹鼷等動物的ApoAⅠ已分離純化。人和其他種屬的ApoAⅠ的氨基末端為Asp，羧基末端為Gln，其分子中不含半胱氨酸和異亮氨酸。經(jīng)等電點聚焦電泳證實，人和動物的ApoAⅠ都是不均一的，有10種不同的亞組份，至少有6種多態(tài)性。

目前所知，ApoAⅠ的氨基酸殘基的排列有其自身的特征：①極性氨基酸殘基含量較多，并以1，2或1，4相反離子對的形式排列，即Glu-Arg、Glu-Lys或Asp=lys、Asp-Arg。②疏水氨基酸殘基一對對地出現(xiàn)在1，2或1，4反離子對的附近，因此很容易形成特有的雙性螺旋二級結(jié)構(gòu)。極性與非極性氨基酸殘基排列的方式是載脂蛋白的一個共性。由疏水氨基酸殘基組成螺旋的非極性面，由帶電荷親水的氨基酸殘基組成螺旋極性面，故稱為雙性螺旋。與一般蛋白質(zhì)的α-螺旋不同，這種雙性螺旋既有親脂的一面又有親水的一面。ApoAⅠ富含雙性螺旋結(jié)構(gòu)，對于維持其正常的生理功能是非常重要的。

ApoAⅠ主要存在于HDL中，在HDL₃中ApoAⅠ占載脂蛋白的65％，在HDL₂中ApoAⅠ占載脂蛋白的62％，在CM、VLDL和LDL中也有少量存在。血漿中呈現(xiàn)β遷移率的一種β-HDL，其內(nèi)80％為ApoAⅠ。

Ⅰ的生理功能有：①組成載脂蛋白并維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與完整性。實驗表明，純化的ApoAⅠ在水溶液中可以自發(fā)地和脂類結(jié)合。用CNBr法將ApoAⅠ裂解成四個肽段，發(fā)現(xiàn)僅有羧基末端的肽段可自發(fā)和磷脂結(jié)合。后來進一步確認這一段是ApoAⅠ224-242段，這一段既可維持雙性螺旋的結(jié)構(gòu)，又可以維持和脂質(zhì)結(jié)合所具備的疏水性。②ApoAⅠ可以激活卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT）的活性。已經(jīng)證實，ApoAⅠ是通過激活LCAT，再催化膽固醇酯化。ApoAⅠ肽段Ⅲ（肽段116-151）是激活作用的中心。③ApoAⅠ可作為HDL受體的配體，含ApoAⅠ脂蛋白可以和轉(zhuǎn)鐵蛋白及銅藍蛋白形成大分子復(fù)合物以運輸鐵和銅離子。

Ⅰ由肝和小腸合成，血漿中生物半壽期為45天。

2.ApoAⅡApoAⅡ是HDL中第二種含量多的載脂蛋白，在HDL₂中占載脂蛋白的15％，在HDL₃中占載脂蛋白25％，在CM中占載脂蛋白的7％-10％，VLDL中也存在少量。到1985年，ApoAⅡ蛋白質(zhì)的氨基酸序列，cDNA序列及基因序列均已闡明。ApoAⅡ是由兩條多肽鏈的77個氨基酸殘基組成。ApoAⅡ在不加還原劑的SDS-PAGE中測出分子量是17ku，在人血漿中以二聚體形式存在。ApoAⅡ的單體分子量為8.7ku。ApoAⅡ蛋白的C端氨基酸殘基為谷氨酸，N端為吡咯烷酮酸，缺乏組氨酸、精氨酸及色氨酸。ApoAⅡ有多態(tài)性存在。

ApoAⅡ生理功能是：①維持HDL結(jié)構(gòu)，ApoAⅡ肽段12-31和肽段50-77具有與磷脂結(jié)合的能力。經(jīng)二級結(jié)構(gòu)分析認為，殘基17-30和51-62形成的雙性螺旋結(jié)構(gòu)是人ApoAⅡ與脂質(zhì)結(jié)合的分子基礎(chǔ)。②激活肝脂酶，用以水解CM和VLDL中的TG和PL。還有報道，ApoAⅡ可抑制LCAT活性。

ApoAⅡ由肝和小腸合成。人血漿中的ApoAⅡ生物半壽期為4.4天。

3.ApoAⅣ最先從大鼠HDL和CM中發(fā)現(xiàn)載脂蛋白AⅣ，以后證實人血漿中也有ApoAⅣ存在，主要分布于密度大于1.211g/ml部分。成熟ApoAⅣ由376個氨基酸殘基組成。經(jīng)SDS-PAGE確認大鼠和人ApoAⅣ分子量為44-46ku。人和大鼠氨基酸組成相似，是一種糖蛋白，含有6％的碳水化合物，其中甘露醇占1.8％，半乳糖占1.55％，N-乙酰葡萄糖胺占1.55％，唾液酸占1.1％。ApoAⅣ有多態(tài)性存在，生物半壽期為10小時。

ApoAⅣ生理功能目前尚不完全清楚，據(jù)推測ApoAⅣ在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程中起著重要作用。體外的ApoAⅣ可以促進LCAT的膽固醇酯化反應(yīng)，并認為是LCAT的激活劑。ApoAⅣ由肝和小腸合成，并有五種多態(tài)型。

（二）Apob族

體外實驗表明，ApoB是難溶于水的蛋白質(zhì)。目前所知，ApoB族可分為兩個亞類，即ApoB₄₈和ApoB₁₀₀。ApoB主要成分是B₁₀₀，其次為B₄₈，其它形式的如ApoB₇₅、ApoB₄₁、ApoB₃₆等均為ApoB₁₀₀的不同降解產(chǎn)物。

1.ApoB₁₀₀ApoB是單鏈糖蛋白，分子量為51ku，主要在肝，少數(shù)在小腸合成。ApoB₁₀₀由4536個氨基酸殘基組成。包括27個（或24）氨基酸信號肽和4536個氨基酸殘基的成熟單體蛋白。1986年ApoB₁₀₀的全部氨基酸殘基排列順序及結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明。當年已測出ApoB₁₀₀的cDNA序列，ApoB₁₀₀分子中含有25個Cys殘基。其中有11個Cys殘基集中分布在前面500氨基酸組成區(qū)域，形成鏈內(nèi)二硫鍵，所以N端高度交聯(lián)成典型球形結(jié)構(gòu)。Cys殘基通過硫酯鍵與軟脂酸、硬脂酸相結(jié)合，使ApoB牢固地連接著脂質(zhì)成分。ApoB₁₀₀中，對脂類結(jié)合十分必要的區(qū)域結(jié)構(gòu)在203-2506和4002-4527氨基酸殘基之間。兩個結(jié)構(gòu)區(qū)域重復(fù)出現(xiàn)兩性親脂α-螺旋區(qū)段；另有一種結(jié)合脂質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)是含疏水和親水性氨基酸交替排列的兩性親脂β-折疊結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)分布在整個分子序列中，但集中于四個富含脯氨酸區(qū)，這種富含脯氨酸的重復(fù)序列是ApoB所特有的，使ApoB能夠?qū)⒘字?a href="/w/%E4%BE%A7%E9%93%BE" title="側(cè)鏈">側(cè)鏈深埋其間并使之緊密結(jié)合。由于ApoB的兩性α-螺旋和富含脯氨酸的疏水肽以及可被脂酰化的Cys殘基形成的特殊結(jié)構(gòu)，在VLDL和LDL從分泌到被清除的整個過程中，使α-螺旋能夠與單層極性脂牢固地結(jié)合，從而使其不在脂蛋白分子間轉(zhuǎn)換，這是與其他載脂蛋白不同之處。

ApoB₁₀₀的生理功能有：①合成裝配和分泌富含甘油三酯的VLDL；②是LDL的結(jié)構(gòu)蛋白。③LDL受體的配體，并可調(diào)節(jié)LDL從血漿中的清除速率。

2.ApoB₄₈ApoB₄₈因分子量是ApoB₁₀₀的48％而得名。存在于CM中，不與其他脂蛋白分子交換。ApoB₄₈在小腸合成，是組裝CM所必需的載脂蛋白。小腸細胞分泌CM后進入淋巴液，并通過胸導(dǎo)管再進入血液循環(huán)，再分布到毛細血管的內(nèi)皮細胞，主要是骨骼肌體和脂肪組織的內(nèi)皮細胞，脂肪酶可水解CM中甘油三酯的80％-90％，剩下的脂蛋白顆粒則稱為CM殘粒，尓后送到肝，被肝脂酶進一步代謝，最后被能夠識別ApoE的殘粒受體攝取。該殘粒受體是LDL受體，還是與LDL受體相關(guān)的蛋白或其他蛋白質(zhì)，目前尚不清楚。

人血漿中ApoB₄₈生物半壽期僅5-10分鐘，分解速度很快，血漿中的濃度很低，約相當于ApoB₁₀₀的0.1％。經(jīng)SDS-PAGE電泳染色在VLDL組分中可檢出痕量的ApoB₄₈。進食豐富的脂肪后，ApoB₄₈/ApoB₁₀₀比值明顯增加。

（三）ApoC族

ApoC是目前所知載脂蛋白中分子量最小的一類。最先從VLDL中分離出一種含有少量磷脂的低分子量載脂蛋白，并命名為載脂蛋白C。此后雙在HDL中發(fā)現(xiàn)有ApoC，并進一步確認ApoC有三種亞型，即ApocⅠ、Ⅱ、Ⅲ。

Apoc是由57個氨基酸殘基組成的單一多肽鏈，其序列已測出，不含半胱氨酸、組氨酸和酪氨酸。分子量為6625u。人ApoCⅠ二級結(jié)構(gòu)中有55％α-螺旋結(jié)構(gòu)，極易與磷脂結(jié)合，它是LCAT的激活劑。

ApoCⅡ是由79個氨基酸殘基組成單一多肽鏈，氨基酸順序已測出，分子量為9110u,有兩種多態(tài)型，pⅠ分別為4.86和4.69。不含半胱氨酸和絲氨酸，其二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋約占23％。ApoCⅡ可激活多種來源的脂蛋白脂肪酶（LPL），其結(jié)構(gòu)中第55-78位氨基酸殘基是維持其對LPL激活作用的最短的必須區(qū)域。羧基端43-50位氨基酸殘基為α-螺旋結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)。

ApoCⅢ由79個氨基酸殘基組成單一多肽鏈，由于第74位蘇氨酸殘基所帶唾液酸個數(shù)不同，又可分為ApoCⅢ₀、CⅢ₁、CⅢ₂三個亞類，也是其多態(tài)性，等電點分別為5.02，4.82和4.62。ApoCⅢ氨基酸序列已測出，分子量為8764u，其二級結(jié)構(gòu)在不同狀態(tài)下，α-螺旋約占22％-54％不等。ApoCⅢ的α-螺旋結(jié)構(gòu)極易與磷脂結(jié)合。

ApoC族生理功能有：①同磷脂相互作用，維持脂蛋白結(jié)構(gòu)：在溶液中呈特殊的立體雙性離子，帶負電荷的酸性氨基酸與磷脂帶正電荷的基團作用，具有很強的磷脂結(jié)合活性。由于與磷脂的相互作用，使ApoC族的α-螺旋結(jié)構(gòu)增加，而磷脂的單個酯酰鏈的運動則受到限制，從而影響磷脂從凝膠態(tài)到液晶態(tài)的轉(zhuǎn)變，兩者作用的結(jié)果，從而固系了脂蛋白的結(jié)構(gòu)；②對酯酶有激活作用，HDL的磷脂在流動性增加時，ApoCⅠ通過HDL脂層表面后促進了LCAT的催化作用；③ApoCⅡ可以激活LPL，其激活機制可能是：LPL通常與外周循環(huán)肝素樣分子結(jié)合并附著于血管內(nèi)皮上，當LPL接觸CM或VLDL時，LPL便同脂蛋白顆粒表面的磷脂發(fā)生作用，進而結(jié)合于脂蛋白顆粒上，其內(nèi)的ApoCⅡ與LPL發(fā)生作用，改變LPL的空間結(jié)構(gòu)，進而催化水解甘油三酯。

Apoc主要由肝合成，小腸也合成少量。

（四）ApoE

ApoE是一種富含精氨酸的堿性蛋白，人AppE由299個氨基酸殘基組成，分子量為34.145ku，含32個Arg和12個Lys，存在于血漿CM、VLDL及其殘粒中，β-VLDL中含ApoE量高于VLDL，一部分ApoE在血液中與ApoAⅡ形成復(fù)合體。已測出ApoE的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，建立ApoE和cDNA序列，并確認ApoE有3個等位基因異構(gòu)體以及基因在染色體上的定位。據(jù)推算和測定，在溶液中ApoE有62％的α-螺旋、9％的β-片層、11％的β-轉(zhuǎn)角和18％的無規(guī)則線團。ApoE分子可以被凝血酶水解為N-端和C-端兩個區(qū)域，N-端區(qū)（1-191）為22ku的可溶性球蛋白，此區(qū)域較穩(wěn)定；C-端區(qū)（216-299）分子量為10ku，螺旋程度很高，不穩(wěn)定，是與脂蛋白的結(jié)合區(qū)，ApoE主要由肝臟合成，近年來發(fā)現(xiàn)腦、腎、骨骼、腎上腺及巨噬細胞也能合成ApoE。

ApoE生理功能有：①是LDL受體的配體，也是肝細胞CM殘粒受體的配體，它與脂蛋白代謝密切相關(guān)；②ApoE具有多態(tài)性，多態(tài)性與個體血脂水平及動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

（五）Apo(a)

早期測定脂蛋白（a）［LP(a)］在人群分布率為30％。目前采用更靈敏的方法發(fā)現(xiàn)幾乎存在于所有人群中，僅是血漿深度差異很大，波動在0-1000mg/L的范圍。1987年克隆了人Apo(a)的基因序列，并推導(dǎo)出氨基酸序列，提示Apo(a)的分子結(jié)構(gòu)與纖溶酶原極為相似。Apo(a)含有一個疏水信號序列，37個Kringle-4拷貝、1個Kringle-5及1個胰蛋白酶樣區(qū)。第36個Kringle-4含有一個額外未配對半胱氨酸，推測此處可能是Apo(a)以二硫鍵與ApoB結(jié)合的部位。經(jīng)胰蛋白酶限制性水解Apo(a)發(fā)現(xiàn)，Apo(a)中的Krtingle-4有75％-85%的氨基酸與纖溶酶原的第391-472個氨基相同，有共同的抗原簇，兩者表現(xiàn)有交叉反應(yīng)。纖溶酶原（PG）是一種絲氨酸蛋白酶原，含有791個氨酸殘基，結(jié)構(gòu)中含有5個富含半胱氨酸的“Kringle”樣結(jié)構(gòu)，即Kringle1-5，在Kringle-5的后面為一絲氨酸蛋白酶區(qū)。PG與Apo(a)結(jié)構(gòu)相似，如圖4-3所示。

圖4-3 載脂蛋白（a）結(jié)構(gòu)示意圖

A:KringleB：纖維蛋白溶酶原C：Apo（a）

Kringle結(jié)構(gòu)是三對二硫鍵組成的三套環(huán)形結(jié)構(gòu)，含有78-82個氨基酸殘基，因其序列的書寫形式酷似一種丹麥面糕而得名。在其第1與第6、第2與第4、第3與第5半胱氨酸上，連成三個硫鍵。這種結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)在前凝血酶、尿激酶、鏈激酶和纖溶酶原激活劑（t-PA）的組份中。由于Apo(a)分子中的Kringle-4數(shù)目可在15-27之間變化，從而導(dǎo)致Apo(a)有多種不同的異構(gòu)體。

Apo(a)結(jié)構(gòu)中有一蛋白酶區(qū)，推測其功能可能是一種酶。在分子中相當于PG蛋白酶的絲氨酸被精氨酸代替，可使其喪失酶的功能。由于Kringle結(jié)構(gòu)與PG相似，推測Apo(a)可能結(jié)合到象PG受體或纖維蛋白那樣的大分子上，再加上LP(a)顆粒攜帶的膽固醇結(jié)合到血管損傷部位，因此它不僅促進動脈粥樣硬化形成，也阻礙血管內(nèi)凝血塊的溶解。

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